白蛋白检测问题

发布时间:2019-01-30       作者:冯仁丰       来源:临床实验室        浏览:7459       收藏: 9

一、白蛋白检测方法回顾

1、上世纪20年代的盐析技术

1921年Howe发表文章,使用硫酸钠沉淀球蛋白,来检测血液中的蛋白。在1938年的Gradwohl的“临床实验室方法和诊断”第二版中,已经采用了该方法原理检测血清中的白蛋白。但是检测蛋白用的是酚试剂。以1.5mol/L的硫酸钠沉淀球蛋白,以Kjeldahl定氮方法或双缩脲方法检测上清液内的白蛋白。盐析方法在国内一直持续到上世纪的70年代。这是一个非常耗时、难以得到可靠结果的方法。临床实验室一直呼吁有直接检测方法。


2、染料结合法

甲基橙是第一个染料,很快有了羟基苯偶氮苯甲酸(HABA),用于与白蛋白结合的检测方法。甲基橙和羟基苯偶氮苯甲酸(HABA)是1950年代最先被引入的用于检测血清白蛋白的染料。甲基橙从来没有被临床实验室接受,因为它的特异性很差,而HABA在1960年代发现有着有限的使用。这些方法一般均依据有机染料与白蛋白结合后使颜色发生变化;染料通常为pH指示剂,所以,必须以缓冲液控制反应混合物的pH[2,3]。HABA在发现被胆红素和各种药物的干扰后名声底下,逐渐被溴甲酚绿(BCG)替代。


Rodkey于1965年推荐了BCG与白蛋白结合的检测方法,但是在pH7.1处试剂空白的吸光度非常高。在BCG的中性缓冲液中,加入白蛋白后因白蛋白与染料的结合使吸光度下降。成为一个方便和直接的检测人血清中的白蛋白方法。将血清用缓冲的BCG溶液进行适当的稀释后,可基本上使吸光度的变化与白蛋白浓度呈线性。在615nm比色,不受胆红素和血红蛋白的干扰。对于极度脂血、混浊的血清亦可以被准确检测。试验说明BCG不与球蛋白结合。磺酞指示剂的阴离子与血清白蛋白结合。在中性pH,白蛋白对BCG的二价阴离子具有高度亲和力,由于从游离的指示剂转换为白蛋白-指示剂的复合物,使615nm处的吸光度有很大的下降。这样可用于成为检测血清中白蛋白的分析方法。本方法较以往的比色方法灵敏得多,对仪器和技术的要求较低。因为白蛋白-BCG复合物有着非常高的结合常数,本方法相对无其他蛋白组分的竞争性干扰。


Bartholomew和Delaney同一年推出应用pH~4。改变了Rodkey的BCG试剂pH,从原pH7.15改为pH3.8。在pH7.15处其吸光度约为2.5。在自动分析仪记录上是一个峰,但重复性很差,因为自动分析仪的管道内被蓝色沉淀覆盖—这是BCG与白蛋白的反应产物,它不是水溶性的。 


Doumas介绍现今BCG方法的产生[5,6]。他说:“1967年,来自巴拿马的Osvaldo Hernandez的培训者,在Alabama医学院的临床病理部门,希望在费城的AACC年会上有一个报告,问我(Doumas)给他一个题目。我告诉他采用Bartholomew和Delaney的溴甲酚绿(BCG)方法,在Technicon的自动分析仪上进行血清白蛋白的检测。为了消除在分析仪中管道内的BCG-白蛋白复合物的沉淀,设想在BCG试剂内加入表面活性剂Brij-35(消除自动分析仪方法的最大问题)。结果表面活性剂却使BCG试剂颜色转变为淡黄色,并消除了蓝色沉淀,但记录的峰依然还在。这就是BCG白蛋白方法的诞生。在AACC会议上的报告得到大家很好的反应,会议主席问‘这个方法真的那样简单?’事实上的确是那样简单。”


BCG对于白蛋白缺少特异性、对血清标本进行两个步骤(快速和缓慢)方法在Doumas等原先文献进行了报道。除了它在特异性上的不利作用外,选择了10分钟反应时间,使BCG方法的结果与电泳接近,当时被考虑为血清白蛋白检测的标准方法。


但该BCG方法缺少特异性,特别在低白蛋白和高白蛋白浓度时,被许多研究者确认;发现因BCG与“急性相反应素”的反应和血清内α-与β-球蛋白组分的反应所致。Gustafsson在血清与试剂混合后的即刻检测吸光度,预防了其他血清蛋白的结合。确实改善了BCG方法的特异性。Gustafsson的发现被多个研究者肯定,用于多个临床实验室的仪器。


对BCG试剂的改良也改善了特异性,现试剂内含有0.3mmol/L BCG、pH4.2的50mmol/L琥珀酸缓冲液、8ml的30%Brij-35、或加入NaCl(0.8mol/L)至BCG试剂。临床仪器校准品的白蛋白值通过与纯人白蛋白得到的标准比较设定。以人血清为基础的校准品内白蛋白值若在BCG试剂的pH或Brij-35的少量变异下没有影响。白蛋白值和BCG试剂内Brij-35浓度间呈反向关系。不可使用牛血清或BSA为基础的校准品。 


BCG被确认对白蛋白不是绝对专一的,因为它也与α1-和α2-球蛋白反应。但若反应时间较短(<25s),正偏倚在1.5g/L到5.0g/L间,平均为3.7g/L。并在血清白蛋白浓度范围内较恒定。为了改善特异性,许多实验室采纳了溴甲酚紫(BCP),BCP较BCG对白蛋白更特异。Louderback等于1968年短篇报道了检测血清白蛋白的BCP方法;以后1970年由Carter报告了较详细的内容。成为自动化方法并评价它的准确度的报告是1978年的Pinnell和Northampton。因为发现BCG方法对非白蛋白的“缓慢”反应,期望寻找特异的染料结合方法,在此需求下,BCP方法出现了。这样BCP方法应运而生。


今天,依据CAP的临床化学调查资料,有54%报告的结果为BCP方法,47%的为BCG方法。BCP方法的血清白蛋白浓度与Laurell电泳免疫检测间具有很好的一致性,而与BCG比较时,BCG的白蛋白结果约高出6.8g/L(恒定误差)。BCP对白蛋白的特异性被多个研究者确认,虽然报告了方法的数个缺点。但是,似乎被国内很多实验室认为:BCP检测的白蛋白结果要比BCG方法的检测结果要特异和可靠。


3、BCP的问题

BCP低估了与胆红素共价结合的血清白蛋白(δ-胆红素)。对于进行长期血液透析的小儿科病人,BCP的白蛋白值在平均水平上偏低7g/L,这是与免疫电泳检测比较得到的;对于肾功能不良病人的白蛋白也偏低。对于连续腹膜透析(CAPD)的慢性肾衰病人的血清白蛋白浓度,BCP方法可以准确检测;但进行血液透析治疗的病人,其血浆白蛋白浓度被低估了。 对血液透析治疗病人的血清白蛋白浓度低估,是因3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF),存在于尿毒症血清内的主要内源性配体物质。进行CAPD或血液透析的病人,具有的血清CMPF水平,相对于健康个体,各自要高出2倍和3.5倍。


4、肝素的干扰问题

肝素也被报告会干扰BCG和BCP方法。BCG方法中血液肝素浓度为90单位/ml的,使血清白蛋白浓度平均减少1.3g/L;当血液收集于7ml肝素化管内,使内含肝素浓度在20单位/ml的,白蛋白不受干扰。该干扰是因使用肝素化血浆替代了血清,形成浊度所致;在BCP方法,可以使乙酸缓冲液摩尔增加至0.25mol/L、或使用含有0.15mol/L NaCl的0.1mmol/L乙酸缓冲液,均可消除干扰。

 

5、BCG还是BCP?

这两个方法均具有优点和缺点,而BCP方法相对于BCG方法并没有明显的优点。BCP的潜在缺点是不同白蛋白制品的BCP-HSA复合物吸光度的变异超过BCG-HSA复合物的吸光度。在Boumas实验室,不同来源的七个不同HSA制品(所有显示纯度>98%,电泳法),以总蛋白分析,以BCP和BCG(25s孵育时间)程序分析白蛋白。结果见表1。


表1. BCP方法对于不同来源纯人白蛋白反应结果不一致

专家论坛-白蛋白检测问题-表1.jpg

上表结果说明HSA制品相对于BCG响应的变异,要好于BCP的响应。可以预期:以BCG为校准品的白蛋白定值不确定度,要小于BCP方法的设定。


表2. CAP室间调查结果

专家论坛-白蛋白检测问题-表2.jpg

表3. 两个方法参考区间一样

专家论坛-白蛋白检测问题-表3.jpg

CAP调查资料说明了,1995年的6100个参加实验室的64%使用了BCG、34%使用BCP。由于BCP较佳的特异性,有人估计在调查标本中的白蛋白值,BCP的要低于BCG约3~5g/L。但是,实际不是这样,很惊讶的是BCG的结果均值要比BCP偏低1.9~3.9g/L(见表2)。但是两个方法报告的正常值(参考区间)在许多情况下这两个方法是一样的(见表3)。


6、临床应用上BCP面临问题很大

BCP方法尽管较特异,但对接受血液透析病人的白蛋白检测偏低,由于存在着3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF),这是内源性尿毒症的毒素,它存在于连续流动腹膜透析的情况下。这个干扰是严重的缺点;但是CMPF对BCG方法没有干扰。 


在评估病人营养的慢性状态中白蛋白水平值已经不断地被认识到了。即使在将来,白蛋白已经被发现是一个未来健康是否良好的指示。


白蛋白浓度与进行肾透析的病人和肾移植病人的存活长短,以及与老年中风病人康复的进展,与骨髓瘤、肝胆硬化和心脏手术等减少发病率和死亡率有着非常相关的关系。


白蛋白的好处与它的浓度即使在正常范围内也与健康呈比例关系;年龄>71岁的群体中,具有白蛋白水平在>43g/L的,与水平在41~43g/L的作比较,死亡率可减少20%~40%。应通过保持血液容量、通过它作为一个抗氧化剂或通过其他代谢功能的保持等的作用,去实现白蛋白对人健康长寿的好处。


上世纪90年代美国对白蛋白的要求:美国健康护理经济行政管理(HCFA)对肾病最后阶段(ESRD)的网络管理部门和“使用ERSRD健康护理专业”组,在他们形成透析机构的质量保证过筛指标中包括了血清白蛋白。腹膜透析病人和所有儿科病人,指标为血清白蛋白>30g/L。


Blagg等比较了235名随意选定透析病人的血清白蛋白浓度,发现BCG方法均值为38g/L,而BCP和免疫散射比浊方法的均值为33g/L;血清白蛋白在BCG和BCP间的平均差异为5g/L,这是从健康成年人的121个样品得到的。在评审这些发现时,Blagg等相信HCFA指标仅对BCG方法是有效的;建议BCP方法的血清白蛋白浓度指标:对于血液透析病人为30g/L,对于腹膜透析病人为25g/L。


在肾移植后低白蛋白血症被认可为死亡率的独立风险因子。在血液透析下的病人白蛋白浓度,较之尿素减少率是更明确的死亡风险的预示指标,死亡的高可能性与偏低的白蛋白浓度有着高度联系。


二、BCG和BCP的染料结合方法至今不清楚反应原理

至今,这样简单的检测方法,其真实反应原理没有弄清楚过。只知道染料能与白蛋白上的某些位置有结合。再则,至今连一个可以为这样的检测方法使用的参考物质都没有。很长时间都一直在使用ERM 470k/IFCC(原CRM 470)为一级参考物质。2013年国际著名专家做过实验,写了文章。文章认为,在ERM-DA470k/IFCC证书内,白蛋白的确认值和有关的不确定度分别为37.2g/L和1.2g/L。这个参考物质由诊断厂商用于直接为他们的方法校准品定值。但是,这个转换正确度的工作,为了不中断计量溯源性链,只有在展示了物质的互换性下方可实施。近期的工作显示了,被检测白蛋白,ERM-DA470k/IFCC检测白蛋白与天然人血清,使用透射比浊和散射比浊检测具有相同表现,确认这个物质是可互换的。

专家论坛-白蛋白检测问题-图1.jpg

图1. ERM-DA470k/IFCC在免疫散射比浊和免疫透射比浊方法间,与患者样品具有互换性。

我们评价了Roche的Tina-quant的白蛋白第二代免疫透射比浊检测产品性能为示例,在Roche Cobas c501分析仪上,使用两个不同批号的试剂。注意这是BCG方法对白蛋白的检测。相隔5个月,在两个相同的实验中检测ERM-DA470k/IFCC的白蛋白浓度。十分惊讶的是,检测ERM-DA470k/IFCC得到的值明显低于预期值,实验均值的均值(34.9g/L)和靶值(37.2g/L)的平均偏移为-6.2%。这个示例强烈地说明:在实现临床实验室常规检测的溯源性中,即使有了被确认的参考物资,但是,这样的参考物质在常规检测中,与诸如白蛋白的染料结合方法(BCG、BCP)一起使用时,这些方法的反应原理都不清楚下,又使参考物质与病人新鲜标本间不具有互换性了!如果实现互换性,该参考物质被常规方法检测的白蛋白值与白蛋白批准值(37.2g/L)应该一样,可惜现在差了2.3g/L!没有互换性。还是被测量的不同。


还是2013年,著名的美国专家Miller WG、Doumas BT、和Lo SF,对美国临床病理学会的室间质量评估中,使用了可以互换的样品检测白蛋白和总蛋白的结果,进行了评估。


结论是,依据生物变异的指标,无论BCG还是BCP的白蛋白方法仅因变异系数值均不具有满意性能。CLIA指标仅考虑不精密度,看来在目前现状下较合适;因为缺少血清白蛋白的协同参考物质和参考物质。由此,现今认识常规的染料结合方法的BCG或BCG白蛋白检测具有溯源性,根本是虚假的。


三、白蛋白检测的前景

目前,世界上越来越重视肾病的透析病人、晚期的肾衰病人、重症监护病人、老年病人等的预后。观察他们血液内白蛋白浓度的含量,是非常重要的指标。可惜文献报道认为,只有使用免疫透射比浊或免疫散射比浊的方法,方可正确了解他们的真实白蛋白浓度。


IFCC的报告充分说明了,现有的染料结合方法尽管使用了国际认可的ERM-DA470k/IFCC(原CRM 470)为参考物质,但因该参考物质只是为免疫方法可提供参考作用;对于使用染料结合方法的白蛋白检测,从“被测量”的认识上,它们从本质上完全与染料结合方法是两个被测量,不可通用ERM470k!换言之,至今国际上尚无适用于染料结合方法的白蛋白参考物质和参考方法。现有的各个公司声明,叙述BCG和BCP方法具有溯源性均为虚假!因此,临床期望得到可靠白蛋白结果,看来将会逐渐考虑采用免疫方法检测人血清白蛋白。


四、最新的报道[9]

白蛋白是血浆的主要成分,约占总蛋白的60%。它是一个非常重要的临床生物标志物,特别在低值时。所以,检测必须准确和稳定。经常使用染料结合方法,如BCG或BCP检测血浆/血清的白蛋白。许多厂商和实验室使用了WHO发表的清单。该清单建议,常规临床生物化学分析物在分析物本身的是固有的,与材料、使用的管子或分析方法无关。我们怀疑这是问题,我们进行了研究储存于第二试管中血浆白蛋白稳定性。对实验室这是一个重要的问题,使用第二试管转运血浆。正如我们实验室一致在做的。


样品收集和准备:静脉全血收集于门诊患者,由经验丰富的采血者采集。对非空腹成年人10人进行静脉采集全血,置于10ml的肝素锂真空采血管内,共两支。初始样品仅离心并在90min内分析。为确保样品均匀,各个患者血浆倒于11.5ml的第二试管混匀,即刻对这个第二试管内样品进行分析。然后,将血浆分为11份,置于3.5ml的第二试管内。试管储存于5℃或21℃,直至分析(5个患者样品置于每个温度)。


在c702 Cobas 8000的临床化学module(Roche)上进行白蛋白的BCP和BCG检测。为了避免分析变异,每个样品进行4次检测使用均值。仪器在该阶段的标准变异为BCP 1.2%和BCG 1.3%。


图1A为BCP检测白蛋白随时间在增加。在21℃下1天或5℃下3天,会增加高于2.15%(消除偏移的目标)。约5天储存后增量达到表现最大,21℃下增量>7%;5℃下增量>5%。比较之下,图1B显示了BCG的白蛋白结果。发现没有显著的变化。图1C概括地显示了,五个各个样品在21℃的实施非常相似。


为了说明问题,作者回顾性地收集以往检测白蛋白结果进行分析。


白蛋白检测均值来自实验室信息系统(2012.1~2014.11)。数据被限制在所有门诊患者,这样预期是均匀的。一部分样品在门诊收集,一部分来自私人医生诊所(GP)。实验室对门诊患者收集的样品,在90min内对原始管经离心和分析。收集GP的样品送到实验室,通过两个不同类型;由GP分装在第二试管的血浆经普通邮件或全血运送服务(21℃)送达。普通邮件约存放在室温16个小时,运送服务则离心和分析<6小时。在评审阶段,使用两个不同分析方法:BCG和BCP(Roche)。

   

专家论坛-白蛋白检测问题-图2-a.jpg

专家论坛-白蛋白检测问题-图2-b.jpg

专家论坛-白蛋白检测问题-图2-c.jpg

图2:第二试管储存在5℃(-*-)或21℃(-θ-)的检测白蛋白浓度图示。

图A和图B中,是在每个时间点下五个血浆样品normalised标准化至原始管的均值。每一点以均值与均值标准误表示。(A)是BCP方法,(B)是BCG方法。(C)在21℃储存后,五个样品患者血浆BCP均值(每个样品四次检测)。asterisk星号表示该时间点的差异超出了相对于原始管的2.15%(p<0.05),这是由配对t-检验确定的。白蛋白浓度的初始范围为:25~43g/L(BCP)和33~49g/L(BCG)。


表1显示了临床数据。对两个相似患者群体的白蛋白进行了比较;样品收集在GP或样品收集在实验室门诊的。这些数据展示了BCP方法对白蛋白检测,对储存/运送的第二试管内的血浆较灵敏。所有三个年龄区间展示了在均值上的差异>0.7g/L(~2%)(p<0.05),将实验室对门诊患者收集的样品,与GP收集的样品、并转送到实验室的在第二试管内的血浆进行比较。在GP收集的样品以全血(转送服务<6h、21℃)、或样品以BCP方法检测,列出的年龄区间均值间差异,与最小的偏移目标比较不显著。


我们以两个不同方法和两个不同温度下,检查了血浆白蛋白的稳定性。当样品储存在第二试管内,我们发现两个广泛使用的方法(BCP和BCG)间的差异。在考虑以生物变异导出的最小性能指标2.15%[5]下,使偏移超出这个指标的时间限值(显著水平p<0.05)的是:21℃为1天;5℃为3天。在这个检测阶段,BCG给出稳定的结果。来自实验室信息系统限制的患者均值,支持了观察的稳定性结果。BCP方法对储存于第二试管敏感,而BCG则显示稳定的结果。


作为常规的生物化学分析物,白蛋白的稳定性会被经常考虑为在分析物本身是固有的,或至少在方法的供应者那里是这样考虑的。我们发现即使相似的方法也不是的。样品或分析物稳定性,由于良好原因,经常关心于全血和分析前阶段。多个研究了全血运送对常规分析物的影响。与我们的研究相反,一些研究已经展示了,分离了细胞的白蛋白可稳定1周。但是,许多上述研究,没有注意对于白蛋白的方法是BCG还是BCP。

555.png

我们也实验了原始管和第二试管(供应者和材料)、管塞、水平和垂直保存等的各种组合。但是,经储存后观察到BCP的白蛋白升高是不可避免的(数据没有展示)。因此,依赖于方法的白蛋白偏移,应是非添加剂所致干扰的因素。


总之,我们的研究显示了,在第二试管内白蛋白的稳定性,取决于使用的方法。血浆的储存和以BCP方法的检测,引起白蛋白值的升高。在21℃下的储存的1天后、在5℃下的储存的3天后,会超过最低性能指标,这是与储存于原始管内样品比较的结果。即使仅仅一个白蛋白检测,具有很小或没有影响患者的诊断和治疗,但是,在血浆储存后观察到的偏移太大不可忽视。


总 结

一个简单的白蛋白检测,却会引出这么多的问题,令人惊叹。离奇的是,连一个样品在运送过程中,还会出现BCG和BCP方法间检测结果的差异!但这又是实验室经常会遇到和发生的!由此,我呼吁临床实验室要像丹麦的实验室那样时刻关心着患者的结果;因为,结果的高低尽管不大,但是从统计学上已经是显著的。对于某个肾病患者来说,高一点或低一点也许会严重影响他的情绪,甚至他的生命。务请关注每个检测结果的可靠性!


文献

Howe PE. The use of sodium sulfate as the globulin precipitant in the determonation of proteins in blood. J Biol Chem 1921; 49:93-108.

Bracken JS, Klotz IM. A simple method for the rapid detection of serum albumin. Am J Clin Pathol 1953; 23:1055-1058.

Rutstain DD, Ingenito EF, Reynolds WE, Burke JM. The determination of albumin in human blood plasma and serum. A method based on the interaction of albumin with an anionic dye-2-(4'-hydroxybenzeneazo)-benzoic acid. J Clin Invest 1954;33:211-221.

Rodkey FL. Direct spectrophotometric determination of albumin in human serum. Clin Chem 1965; 11:

Doumas BT,Watson WA,Biggs HG. Albumin standards and measurement of serum albumin with bromcresol green. Clin Chim Acta 1971;31:87-96.

Doumas BT, Peters Jr Theodore. Origins of dye-bingding methods for measuring serum albumin. Clin Chem 2009; 55: 583-584.

Infusino I, Panteghini M. Serum albumin: accuracy and clinical use. Clin Chim Acta. 2013;419:15-18.

Lo SF, Miller WG, Doumas BT. Laboratory performance in albumin and total protein measurement using a commutable specimen. Results of a College of American Pathologist Study. Arch Pathol Lab Med.2013;137:912.

Christensen PA. Stability of plasma albumin depends on measurement method. Clin Chem Lab Med 2016;54(11):e327-e329

二维码宣传.jpg

本文链接:http://www.ddm360.com/article/detail/808
版权所有,转载时请以链接的形式注明来源!
相关主题: 血浆游离